泛素（Ub）与底物蛋白共价键的形成称为泛素化修饰，导致底物蛋白稳定性、细胞定位和/或活性的改变，从而广泛参与细胞重要的生命活动。罗招庆教授团队在之前的研究（Nature, 2016）中发现，军团菌IV型分泌系统效应蛋白SidEs家族通过水解NAD+，介导Ub发生单-ADP-核糖基（ADPR）化，生成ADPR-Ub。并随之将其切割，在释放AMP的同时将磷酸核糖基泛素（PR-Ub）连接到底物蛋白的丝氨酸残基上，形成了一种全新的泛素化修饰方式——磷酸核糖基泛素化。这种特殊的泛素化修饰可以被其他效应蛋白所调控，例如DupA和DupB可以表现出去泛素化酶活性，将PR-Ub从底物上切割下来，形成游离的PR-Ub。

然而，PR-Ub和其前体ADPR-Ub都不能参与经典的泛素化反应，并且它们的积累会干扰感染细胞中的关键信号级联反应，反而不利于军团菌的复制。因此，军团菌需要将PR-Ub还原成可以参与正常泛素化反应的Ub，维持Ub的稳态，维持有利于自身生存和复制的环境。

2024年7月15日，吉林大学第一医院感染性疾病与病原生物学中心/呼吸与危重症医学科罗招庆/宋磊团队在《Nature Communications》杂志在线发表了题为“Legionella maintains host cell ubiquitin homeostasis by effectors with unique catalytic mechanisms”的工作。该研究发现军团菌效应蛋白LnaB作为一种全新的单磷酸腺苷化转移酶，通过其S-HxxxE结构域将ATP水解成AMP和焦磷酸，并将AMP基团转移到PR-Ub的磷酸基团上，形成ADPR-Ub。在另一效应蛋白MavL的作用下，ADPR-Ub被还原成ADPR和Ub，从而减少细胞中PR-Ub的蓄积并恢复正常Ub的水平。

图1 效应蛋白MavL是一种针对ADPR-Ub的ADPR水解酶

首先本研究鉴定了嗜肺军团菌中与Ub有相互作用的效应蛋白。在这其中， MavL能够高效地将ADPR-Ub水解为ADPR和Ub（图1a）。三个氨基酸残基（D315、N322和D323）对于MavL针对ADPR-Ub的水解活性至关重要（图1b）。此外，与野生型军团菌（WT）感染的细胞相比，MavL敲除突变体（∆mavL）感染的细胞中ADPR-Ub的水平显著增加。回补MavL而非突变体MavLD323A，可以恢复WT感染的表型（图1f），这表明MavL在感染细胞中的作用是降低ADPR-Ub的水平。

图2 效应蛋白LnaB是一种腺苷基转移酶，它将PR-Ub转化为ADPR-Ub

mavL基因的上游是LnaB，因此推测LnaB可能具备将PR-Ub转化为ADPR-Ub的能力。可是，当重组LnaB与PR-Ub和ATP反应时，并未观察到明显的ADPR-Ub生成（图2a）。 进一步研究发现在反应中加入宿主肌动蛋白（Actin）促使ADPR-Ub的形成（图2d）。这些结果表明，LnaB被宿主Actin蛋白激活后，发挥腺苷基转移酶活性，将PR-Ub转化为ADPR-Ub。

图3 LnaB通过S-HxxxE结构域来催化PR-Ub转化为ADPR-Ub

LnaB含有一个保守的S-HxxxE结构域，由S261、H305和E309构成，三个位点的任意点突变均完全消除了LnaB的腺苷酸转移酶活性（图3a，b）。较WT感染的细胞，感染ΔlnaB突变菌株的细胞中PR-Ub水平显著增加（图3c）。此外，当在ΔlnaB菌株中过表达SdeA时，军团菌胞内生长出现明显缺陷，通过回补LnaB但不是其酶活失活的突变体，可以弥补这种生长缺陷（图3f）。这些结果表明，LnaB通过腺苷酸转移酶活性清除感染细胞中积累的PR-Ub，从而有利于军团菌的胞内生长。

图4 LnaB及其他S-HxxxE家族成员催化蛋白质单磷酸腺苷酸化修饰（AMPylation）

在无底物PR-Ub的情况下，LnaB催化自身AMPylation修饰（图4a，b）。作者进一步分析了S-HxxxE毒力蛋白家族一些其他成员的自我单磷酸腺苷化修饰能力。在检测的五种毒力蛋白中，Tba675和Tei158可轻易检测到自身的AMPylation，而0750、1483和MAZ443只可检测到微弱的自身AMPylation（图4d）。并且，完整的S-HxxxE结构域对于这些蛋白自我修饰活性是必需的（图4d）。这些结果表明，至少一部分 S-HxxxE 毒力蛋白家族成员的生化活性是介导底物的 AMPylation。

【结论与展望】

嗜肺军团菌的致病策略高度复杂，其关键在于分泌多种效应蛋白精确调控宿主细胞的各项功能。例如，SidEs家族效应蛋白能够参与产生PR-Ub，干扰宿主蛋白的正常泛素化过程，从而为病原菌的胞内生长创造条件。罗招庆/宋磊教授课题组在军团菌致病机制研究方面取得了系列突破，他们先后揭示了SidJ（Nature，2019）和SdjA（mBio，2019）等效应蛋白在调控PR-Ub生成中的作用机制。

本研究进一步拓展了该领域的认知边界：效应蛋白LnaB与MavL协作，将PR-Ub经ADPR-Ub还原为功能性Ub，从而有效清除积累的PR-Ub，维持宿主细胞内泛素稳态，为军团菌的生存和复制营造有利环境（如图5）。

值得一提的是，细菌毒力蛋白S-HxxxE结构域的生化活性一直是悬而未解的谜题。本研究通过对LnaB的深入研究，首次揭示了S-HxxxE结构域的催化活性，为理解其功能提供了关键线索。

总之，该研究不仅深化了对嗜肺军团菌致病机制的认识，为开发新型抗感染药物提供了重要的理论依据，同时也为解析蛋白翻译后修饰等重要生命活动机制开辟了新的研究方向。

图5 嗜肺军团菌效应蛋白对感染细胞中对泛素稳态的调控机制

吉林大学第一医院罗招庆教授和宋磊教授为该文章的通讯作者，吉林大学第一医院付嘉琦教授和李思莹博士为共同第一作者。该研究合作者还有北京大学刘小云教授团队和福建师范大学欧阳松应教授团队，研究得到国家自然科学基金重点项目、面上项目和吉林省科技厅项目等支持。